Stok gliserol adalah jenis suspensi yang digunakan dalam pengaturan laboratorium untuk menyimpan kultur bakteri untuk waktu yang lama. Ketika biakan bakteri cair ditambahkan ke dalam larutan gliserol 50%, gliserol meresap ke dalam sel bakteri, membuatnya stabil secara struktural dan memungkinkan mereka untuk disimpan dengan aman. Setelah mencampur sampel Anda, bekukan pada 80 °C (−112 °F) untuk memastikan sampel tetap layak selama mungkin.
Langkah
Bagian 1 dari 3: Mencampur Larutan Gliserol
Langkah 1. Siapkan biakan cair bakteri yang ingin Anda simpan
Agar stok gliserol menjadi efektif, harus dikombinasikan dengan kultur bakteri cair. Memproduksi kultur cair akan mengharuskan Anda untuk menginkubasi sampel bakteri semalaman dalam labu Erlenmeyer yang diisi dengan kaldu lisogen dan konsentrasi antibiotik yang tepat.
- Setelah Anda menyiapkan biakan cair, Anda dapat memasukkan bakteri ke dalam penyimpanan atau melanjutkan untuk mengisolasi DNA plasmid.
- Kaldu lisogen (juga dikenal sebagai "kaldu LB" dan "cairan LB") adalah jenis cairan kaya nutrisi yang digunakan untuk memperbanyak bakteri dengan cepat. Itu dapat dibeli dari pengecer yang menjual peralatan dan bahan laboratorium.
- Inkubasi kultur bakteri adalah proses yang sangat teknis yang melibatkan banyak variabel yang berbeda. Untuk alasan ini, paling baik dilakukan oleh teknisi terlatih dalam pengaturan laboratorium yang terkontrol.
Langkah 2. Encerkan gliserol murni dalam air suling untuk membuat larutan gliserol 50%
Gunakan pipet steril untuk mengukur 10 mL kedua cairan dan gabungkan dalam satu labu. Aduk atau kocok labu secara menyeluruh sampai cairan tercampur secara merata.
- Mengencerkan gliserol diperlukan untuk mencegahnya merusak sel bakteri.
- Beberapa ilmuwan lebih suka menggunakan larutan gliserol serendah 15-40% untuk menghindari kompromi kultur bakteri. Namun, campuran 50% akan memberikan umur panjang maksimum dalam penyimpanan.
Langkah 3. Pindahkan 50 mikroliter larutan gliserol 50% ke tabung microfuge
Pindahkan gliserol encer ke botol baru dengan hati-hati untuk menghindari tumpahan. Anda akan menggunakan wadah yang sama ini untuk memasukkan larutan gliserol dengan kultur bakteri cair dan menempatkan sampel ke dalam penyimpanan dingin.
Jika memungkinkan, gunakan tabung dengan sekrup di bagian atas daripada yang memiliki bagian atas. Tabung atas jepret diketahui terbuka secara tidak sengaja selama pencampuran dan penyimpanan yang lama
Bagian 2 dari 3: Menambahkan Kultur Bakteri
Langkah 1. Tambahkan 50 mikroliter kultur bakteri cair Anda ke dalam larutan
Gunakan pipet segar untuk mengukur jumlah yang sama dari kultur cair dan tuangkan langsung ke dalam larutan gliserol dalam tabung. Proporsi akhir stok gliserol Anda harus 50% bakteri dan 50% gliserol encer.
- Menggunakan gliserol dan kultur cair dalam jumlah yang tidak proporsional dapat memengaruhi daya tahan bakteri dan mengurangi jumlah waktu yang dapat bertahan dalam penyimpanan dingin.
- Jika Anda menggunakan larutan gliserol dengan konsentrasi yang lebih rendah, Anda harus menyesuaikan jumlah kultur bakteri yang sesuai. Konsultasikan literatur yang berkaitan dengan strain yang tepat yang Anda simpan untuk informasi lebih lanjut.
Langkah 2. Tempatkan tutup pada tabung
Pasang tutupnya ke tempatnya, atau tekan ke bawah hingga Anda mendengar bunyi klik lembut jika Anda menggunakan tabung snap top. Konfirmasikan bahwa tutupnya aman sebelum melanjutkan.
Langkah 3. Kocok tabung dengan lembut untuk mencampur kultur bakteri dan gliserol
Kocok tabung bolak-balik beberapa kali sampai kedua cairan merata. Pada titik ini, sel bakteri perlahan akan mulai menyerap larutan gliserol, yang akan menstabilkan dan melindungi membran sel dari kerusakan dan kerusakan terkait suhu.
Tahan ibu jari Anda dengan kuat pada tutup tabung microfuge sambil menggoyangkannya untuk memastikannya tidak lepas
Bagian 3 dari 3: Menyimpan dan Menghidupkan Kembali Kultur Bakteri
Langkah 1. Label sampel bakteri
Tulis nama biakan pada label tabung reaksi kecil atau strip selotip dan tempelkan pada tabung mikro di tempat yang akan terlihat jelas. Anda juga dapat menuliskan info klasifikasi bakteri langsung ke tutupnya menggunakan spidol berujung runcing.
- Pastikan juga untuk mencatat informasi lain yang mungkin berguna selama analisis, seperti regangan yang tepat dari sampel atau asalnya.
- Memberi label pada wadah sampel Anda adalah langkah yang sangat diperlukan dalam proses pengumpulan, karena memungkinkan Anda untuk melacak isinya saat dipindahkan ke dalam dan di luar penyimpanan.
Langkah 2. Bekukan sampel pada 80 °C (−112 °F)
Tempatkan sampel berlabel dalam freezer laboratorium superdingin yang disetel ke suhu konstan -80 °C (−112 °F). Ketika disimpan dalam kondisi ini, kultur bakteri akan tetap bertahan selama beberapa tahun.
Sangat penting bahwa suhu freezer tetap pada 80 °C (−112 °F). Jika diatur lebih hangat, bakteri yang diawetkan bisa mati
Langkah 3. Kerok sejumlah kecil bakteri beku untuk mempersiapkannya untuk dianalisis
Ketika tiba saatnya untuk menghidupkan kembali sampel Anda, keluarkan tabung microfuge dari freezer dan buka tutupnya. Gunakan loop inokulasi steril, tusuk gigi, atau ujung pipet untuk mengumpulkan sejumlah kecil bahan beku dari bagian atas sampel dan gores bakteri ke piring agar LB untuk pemeriksaan atau pengujian.
- Berhati-hatilah agar bakteri yang mengikis tidak mencair. Mungkin membantu untuk menyimpan tabung stok di atas es kering sampai Anda menyelesaikan tes Anda.
- Keluarkan sampel Anda dari freezer hanya jika benar-benar diperlukan. Pencairan dan pembekuan ulang yang berulang akan sangat mengurangi umurnya.